ISSN 2953-3740
VOL. 1 NÚM. 1 enero-junio 2022
REVISTA CIENTÍFICA DE
ABEJAS Y APICULTORES
EUNK - Revista Científica de Abejas y Apicultores
Editorial EUNK
www.eunk.org
ISSN en línea: 2953-3740
Volumen 1 (2022), Número 1
EQUIPO EDITORIAL
DIRECTOR
Sergio Ruffinengo
EDITORA GENERAL
Leticia Fernández
EDITORES DE SECCIÓN
Economía, Política y Cultura
María Emilia Estrada
Biología de las Abejas
Francisco Reynaldi
Nutrición y Sanidad de las Abejas
Natalia Damiani
Producción y Calidad de los Productos de las
Abejas
Liliana M. Gallez
Polinización y Flora Apícola
Cristina R. Salgado
Abejas y Medioambiente
Sandra K. Medici
SECRETARIOS EDITORES
Danilo Rübenacker
EDITORIAL
En un mundo donde el incremento en la producción
de alimentos se hace cada vez más determinante, el rol
de los insectos polinizadores adquiere relevancia debido
a su relación con la mejora en los rendimientos de una
gran cantidad de cultivos utilizados por el ser humano.
Apis mellifera, ocupa en la actualidad un lugar
importante en la polinización de cultivos y, como
productora de miel, motoriza a todo un sector productivo
que ha colocado a la República Argentina entre los
países exportadores y productores más importantes del
mundo. La Apicultura es una actividad de gran impacto
social, ambiental y económico. De allí que la
articulación entre los sectores científico y productivo sea
tan relevante a la hora de lograr una producción
sostenible. En la sinergia que inevitablemente se genera
con esa interacción, emergen muy buenas ideas y una de
ellas es EUNK.
La Revista EUNK nace con el compromiso de
transformarse en un espacio de referencia para la
difusión científica, el desarrollo innovativo y la
extensión a niveles nacional e internacional, y como
fruto de un enorme esfuerzo en conjunto de productores
y técnicos que conforman la Cámara de Apicultores
Pampero y Cooperativa de Trabajo Apícola Pampero
Limitada con la cooperación de importantes Grupos de
Investigación de diferentes universidades nacionales:
Universidad Nacional del Sur, Universidad Nacional del
Nordeste, Universidad Nacional de La Plata y
Universidad Nacional de Mar del Plata. EUNK es una
palabra que proviene de la lengua tehuelche, que
significa “mirar lejos” y que resume nuestras
expectativas en cuanto a la proyección estratégica y
superadora que se busca promover. Es la primera revista
digital y de libre acceso de la Argentina, que persigue
como objetivo principal la publicación de estudios
científicos originales acerca de las abejas, la apicultura
y los/as apicultores/as, abarcando la complejidad del
sector en su totalidad.
En este primer número se presentan tres trabajos bien
diferenciados en cuanto al tópico que abordan. Uno de
ellos, es un estudio realizado por N. Zsawarski y
Enero - Junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 2
colegas, sobre el efecto del ácido abscísico en abejas
durante el invierno, teniendo en cuenta posibles
variaciones en el desarrollo de la población, en la
dinámica de la nosemosis y en la expresión génica
vinculada a la nutrición y la inmunidad. En otros dos, S.
Villamil, L. Marinozzi y F. Ess evaluaron el impacto de
la polinización entomófila en la producción de semilla
de trébol rojo y E. Caliguli y colegas analizaron distintos
parámetros fisicoquímicos de mieles provenientes de la
Provincia de Mendoza.
Aprovecho este espacio para agradecer a todos/as y
cada uno/a de los/as que hicieron que este proyecto
empiece a rodar y a recorrer los distintos caminos que la
apicultura nos impone.
Sergio Ruffinengo
Director
Derechos de Autor (c) 2022 Sergio Ruffinengo
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EUNK - Revista Científica de Abejas y Apicultores
Editorial EUNK
www.eunk.org
ISSN en línea: 2953-3740
Volumen 1 (2022), Número 1
https://doi.org/10.52559/eunk.v1i1.22
ARTÍCULO ORIGINAL
Evaluación fisicoquímica de mieles comercializadas en la provincia de
Mendoza (Argentina)
Elena E. Caliguli 1, Laura V. Arévalo1, Liliana E. Tonini1, Alejandra Grosso1 y Damián G. Sanchez Mantica1
1 Centro de Investigación, Desarrollo, Extensión y Servicios “Padre Francisco Oreglia”, Facultad Don Bosco de Enología y Ciencias de la
Alimentación, Universidad Católica de Cuyo. Mendoza, Argentina.
E-mail de contacto: investigacionesrodeo@donbosco.org.ar
Recibido: 3 noviembre 2021; aceptado: 2 junio 2022; publicado: 30 junio 2022
Resumen
Las mieles oriundas de una región poseen características únicas que las diferencian de otras, debido a su origen botánico normalmente.
Estudiar los parámetros que permiten conocer las características intrínsecas del alimento, resulta de gran interés en la actualidad. Los
objetivos del trabajo fueron evaluar muestras de miel comercializadas en la provincia de Mendoza con el fin de conocer sus
características fisicoquímicas, su relación con los parámetros legislados y comparar dichas variables en las mieles provenientes de
diferentes zonas de la provincia de Mendoza. Se trabajó sobre sesenta muestras (n=60) obtenidas de cinco zonas productivas
correspondientes a la cosecha 2020/21 y se implementaron metodologías de análisis y trabajo estandarizadas. Las variables
fisicoquímicas analizadas permitieron identificar diferencias significativas entre zonas y proponer estudios posteriores específicos
sobre ciertas variables para determinar la influencia del entorno geográfico y el origen botánico.
Palabras clave: Mendoza, miel, parámetros fisicoquímicos.
Physicochemical evaluation of honeys commercialized in the province of Mendoza (Argentina)
Abstract
The honeys originating from a region have unique characteristics that differentiate them from others, due to their botanical origin,
normally. Studying the parameters that allow knowing the intrinsic characteristics of the food is of great interest today. The objectives
of the work were to evaluate samples of honey marketed in the province of Mendoza in order to know their physicochemical
characteristics, their relationship with the legislated parameters and compare these variables in honey from different areas of the
province of Mendoza. Work was carried out on sixty samples (n=60) obtained from five productive zones corresponding to the 2020/21
harvest and standardized analysis and work methodologies were implemented. The physicochemical variables analyzed made it
possible to identify significant differences among zones and to propose specific subsequent studies on certain physicochemical
variables in order to determine the influence of the geographical environment and the botanical origin.
Keywords: Mendoza, honey, physicochemical parameters.
INTRODUCCIÓN
En la actualidad la producción apícola representa un
sector socio económico productivo de gran importancia.
Argentina se ha enmarcado internacionalmente como
uno de los mayores productores de miel, destacándose
por su calidad y cumplimiento de los estándares
establecidos por los mercados consumidores. La
provincia de Mendoza está situada entre los 32° y 37°
35´de latitud sur y los 66° 30´y 70° 35´de longitud oeste
en la región centro oeste de Argentina. Su clima
desértico y semi árido influye directamente sobre el tipo
de vegetación y la disponibilidad de alimento para las
abejas, principalmente Apis mellifera.
Argentina históricamente se ha posicionado como
exportador de miel a granel debido a varios factores,
entre estos, la demanda de mercados consumidores,
calidad y tipo de mieles obtenidas de alto interés en la
E. Caliguli et al.
Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 4
industria internacional, alrededor de un 95 % de la
producción nacional se exporta y lo restante se destina
al mercado interno (Ministerio de Hacienda de la
República Argentina, 2018).
Los rendimientos de miel por colmena varían
dependiendo las zonas y las condiciones ambientales.
Zonas de regadío, frutales o cultivos florales inciden
beneficiosamente a la producción. En regiones como la
de Cuyo, los rindes en miel son menores y por lo tanto
la prevalencia de la actividad es dificultosa (Sanchez
Mantica, 2022).
La mayoría de los emprendimientos apícolas en la
región son de pequeña y mediana escala, entre 50 hasta
500 colmenas respectivamente. Normalmente dichas
explotaciones son del tipo familiar y utilizan tecnologías
tradicionales. Los rindes en la provincia de Mendoza
promedian los 25 kg de miel por colmena (Ministerio de
Economía de la Provincia de Mendoza, 2022). Para el
año 2020 se registraron más de 100000 colmenas y 500
apicultores (Ministerio de Agricultura, Ganadería y
Pesca de la Nacion Argentina, 2020).
Múltiples proyectos buscan lograr una tipificación o
caracterización de mieles según su origen tanto botánico
como geográfico, con el fin de obtener un valor
agregado diferencial y/o posicionarlas como producto
regional. Un estudio llevado a cabo en el departamento
de Malargüe al sur provincial abarca estos aspectos
desde la óptica de los análisis fisicoquímicos,
sensoriales y polínicos; aportando al conocimiento y
descripción de las mieles obtenidas en dicho
departamento (Jiménez & Greco, 2017).
La apicultura en la provincia es parte de la economía
regional y es llevada a cabo fundamentalmente dentro
de los oasis productivos Norte, Sur, Este, Valle de Uco
y Gran Mendoza (Ministerio de Economía de la
Provincia de Mendoza, 2022).
Los procesos productivos llevados por el hombre
sobre la miel varían dependiendo la idiosincrasia de los
mismos, zonas geográficas, niveles productivos,
tecnologías existentes y poder adquisitivo de los
emprendimientos.
Se puede identificar un proceso propio llevado por
las abejas en la obtención de la miel como tal y en
segundo lugar el trabajo del apicultor con las abejas
mismas. Esto se puede traducir en un proceso primario
o agrícola y posteriormente procesos como extracción y
adecuación de la miel que implican una manufactura
serían procesos secundarios o industriales.
En cuanto a las distintas etapas dentro de la cadena
de valor de la miel, es muy importante implementar en
la producción primaria, buenas prácticas agrícolas y
buenas prácticas apícolas con el fin de resguardar la vida
y potencialidad de los apiarios y sus entornos. Las
buenas prácticas de manufactura permitirán desarrollar
todas aquellas etapas de procesamiento que serán
esenciales para asegurar la calidad del alimento. Asentar
un sistema de trazabilidad que permita conocer todo el
camino que ha recorrido el alimento a lo largo del ciclo
productivo hasta llegar al consumidor final, sumando a
las cadenas de suministros y todas aquellas actividades
relacionadas a la cadena productiva. Estas herramientas
permitirán poder llevar adelante un seguimiento
continuo de las producciones, prevenir posibles
amenazas y tomar medidas correctivas ante desvíos
(Sanchez Mantica, 2022).
El Código Alimentario Argentino (CAA) en su
artículo 782 (Res. 2256, 16/12/1985) denomina a la Miel
o Miel de abejas como el producto dulce elaborado por
las abejas obreras a partir del néctar de las flores o
exudaciones de otras partes vivas de las plantas o
presentes en ellas, que dichas abejas recogen,
transforman y combinan con substancias específicas
Fig 1. Zonas de la provincia de Mendoza
Evaluación fisicoquímica de mieles comercializadas en la provincia de Mendoza (Argentina)
5 Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1
propias, almacenándolo en panales, donde madura hasta
completar su formación (Código Alimentario
Argentino, 1985).
La composición global de una miel depende del
origen botánico, las características del clima, la raza de
abejas, entre otros factores. Se han identificado más de
180 sustancias diferentes en la miel, algunas de las
cuales en exclusividad (Crane, 1985).
El principal ácido presente en las mieles es el
glucónico y otros en cantidades menores como el
fórmico, acético, cítrico, láctico, maleico, málico,
oxálico, piroglutámico y succínico. El pH de las mieles
de flores varía entre 3,3 a 4,6. Las mieles provenientes
de mielada debido a su mayor contenido de minerales,
tienen un valor de pH más alto, que varía entre 4,5 y 6,5
(Bogdanov, 2011). Mieles analizadas en la provincia de
Formosa (Argentina) presentaron valores de pH
comprendidos desde 3,3 hasta 5,3 y de acidez libre entre
9,75 y 59,25 meq/kg (Cabrera & Santander, 2022).
En mieles argentinas provenientes de la provincia de
Mendoza fueron reportados valores comprendidos entre
0,37 y 0,62 g% de contenido proteico (Fattori, 2004).
Muestras analizadas por metodologías de alta resolución
mostraron que los aminoácidos predominantes son la
prolina seguido de la fenilalanina, advirtiendo la
influencia de las reacciones de Maillard en dichas
concentraciones (Quintas et al, 2021).
Respecto a cenizas de la miel se han observado
compuestos tales como K2O, Na2O, CaO, MgO y P2O5;
Cl, S, B, Si y Al; metales pesados tales como Cd, Pb y
Zn en mayor proporción en las mieles de mielada y
compuestos de P entre los cuales predominan los
fosfatos alcalinos. En mieles argentinas se han reportado
en cuanto minerales valores de hasta 5 mg% de Na, 26
mg% de K, 5 mg% de Ca, 2 mg% de Mg, 300 µg% de
Fe, 80 µg% de Mn y 132 µg% de Cu (Fattori, 2004).
Recientemente un estudio evaluó la calidad de las
mieles comercializadas en la provincia de Mendoza,
focalizándose desde la óptica de la legislación vigente y
los parámetros de calidad aplicables en miel (Sanchez
Mantica, 2022). En él se destaca que los valores
analíticos promedio obtenidos se encontraron dentro de
los parámetros legislados, aunque, variables como
hidroximetilfurfural, acidez libre, cenizas y color
presentaron valores por encima de las tolerancias y
valores por debajo de los especificados en las normas en
cuanto al índice de diastasas.
Los objetivos del trabajo fueron evaluar muestras de
miel comercializadas en la provincia de Mendoza con el
fin de conocer sus características fisicoquímicas, su
relación con los parámetros legislados y comparar
dichas variables en las mieles provenientes de diferentes
zonas de dicha provincia.
MATERIALES Y MÉTODOS
La metodología de la investigación para el desarrollo
del trabajo fue del tipo mixta. El universo muestral
estuvo constituido por 60 muestras en total (n=60),
siendo recolectadas 12 muestras por cada zona de la
provincia de Mendoza.
Las muestras de miel fueron proporcionadas en parte
por productores mendocinos que realizan venta directa
de miel y por otra parte adquiridas en centros de
comercialización de la provincia de Mendoza; todas
correspondientes a la cosecha 2020/21.
La metodología de muestreo que se realizó fue la
detallada por AOAC Official Meth. 920.180. (1995).
Las muestras fueron representativas del lote al que
pertenecían y conformadas por 500 g de contenido neto
cada una, en recipientes de vidrio con cierre hermético,
mantenidas hasta su análisis al abrigo de la luz y de
temperaturas ambientales extremas. Se codificó cada
muestra en base a las zonas que se corresponden al
origen geográfico de recolección de las muestras, según
el siguiente detalle: Gran Mendoza (zona A), Valle de
Uco (zona B), Oasis Norte (zona C), Oasis Sur (zona D),
Oasis Este (zona E) (Fig. 1).
La metodología de preparación de muestras en
laboratorio fue según la IRAM 15976: 2007.
Las determinaciones fisicoquímicas se realizaron
por triplicado bajo los métodos oficiales de la AOAC
(A.O.A.C, 1995), llevadas a cabo en un mismo espacio
de tiempo y los resultados estadísticamente
contemplados (Tabla 1).
Los datos obtenidos fueron procesados y analizados
estadísticamente. Para el análisis estadístico de los
parámetros fisicoquímicos se utilizó el software InfoStat
para Windows (versión 2016e) y XLSTAT para el
estudio de la varianza ANOVA y test de Tukey (HSD).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados fisicoquímicos
Se cuantificaron los siguientes parámetros: Azúcares
Reductores, Sacarosa Aparente, Humedad, Cenizas,
Sólidos Insolubles en Agua, Acidez libre, Acidez
lactónica, Acidez total, pH, índice de Diastasas (ID),
Hidroximetilfurfural (HMF) y Color (Tabla 2).
Las muestras de mieles evaluadas de la provincia de
Mendoza, presentan un valor promedio de Azúcares
Reductores (71,533 %) por encima del mínimo
establecido (miel de flores 65 %, miel de mielada y sus
mezclas 60 %) por el CAA; de Sacarosa Aparente (1,312
E. Caliguli et al.
Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 6
%) muy por debajo del máximo establecido (Miel de
flores 8 %, miel de mielada y sus mezclas 10 %); de
Humedad (16,2 %) por debajo del máximo establecido
(18 %), por otro lado, se obtuvo un valor máximo de
19,5%, superando el límite establecido. Las razones por
la que se presentó dicha humedad podrían ser múltiples,
a modo general se puede atribuir a una inmadurez de
dichas mieles al momento de la cosecha. El 5 % de las
muestras en estudio presentaron un contenido superior
al 18 %, máximo establecido por CAA.
En cuanto a sacarosa aparente se mantiene una
misma tendencia en cuanto a su concentración entre la
mayoría de las muestras, siendo valores por debajo de
los máximos estipulados por la normativa. En cuanto a
cenizas (0,360 %) se encontró por debajo del máximo
establecido (Miel de flores 0,6 %, miel de mielada 1 %),
el contenido de cenizas es relativamente moderado,
presentando un 20 % de las muestras en estudio que
corresponderían a mieles de mielada en base a los
límites establecidos por CAA, aunque es necesario
aclarar que ciertas especies nectaríferas propician
naturalmente mieles con mayores contenidos de cenizas
y conductividad eléctrica. Será propicio continuar con
estudios posteriores y específicos para determinar la
posible presencia de mielatos.
Respecto a sólidos insolubles en agua (0,112 %) en
algunos casos superan el máximo establecido (miel no
prensada 0,1 %, miel prensada 0,5 %). El 25 % de las
muestras en estudio presentaron un contenido mayor a
0,1 % e inferior a 0,5 %, se puede asociar a los procesos
de manipulación durante el ciclo productivo del
alimento.
La acidez libre (36,205 meq/kg) en promedio se
encontró por debajo del máximo establecido (40
Determinación
Método
pH
IRAM 15938: 2007
Acidez total: libre y lactónica
AOAC 962.19. (1995). Acidez en miel (Acidez total: libre y lactónica).
Humedad
AOAC Official Meth. 969.38B (1995).
Índice de diastasas
AOAC Official Meth. 958.09. (1995).
Cenizas
AOAC 920.181. 8. (1995).
Sólidos insolubles
Codex Alimentarius CAC/VOL.II - 1ª ed. Suplemento II.
Azúcares reductores
Codex Alimentarius CAC/VOL III, supl. 2 sección 7.1, 1° Ed.
Sacarosa aparente
Codex Alimentarius CAC/VOL III, supl. 2 sección 7.1, 1° Ed.
HMF Cuantitativo
AOAC Official Meth. 980.23 (1995)
Color
IRAM 15941 – 2: 2007: determinación del color Pfund.
Tabla 1. Metodología analítica oficial utilizada para los anlisis de las variables fisicoqumicas de las muestras de miel.
Media
Desviación estándar
Mínimo
Máximo
71,53
4,71
65,18
85,20
1,31
0,71
0,51
3,05
16,21
1,06
13,10
19,50
0,36
0,3
0,09
0,99
0,112
0,120
0,007
0,645
46,50
19,84
19,94
100,38
36,21
19,78
10,97
94,20
10,30
4,04
4,49
24,43
3,83
0,33
3,11
5,07
31,97
21,82
4,27
67,87
16,56
19,21
0,00
95,62
72,9
31,3
12,0
121,0
Tabla 2. Estadsticos descriptivos de las variables fisicoqumicas de las muestras de miel de la provincia de Mendoza.
Evaluación fisicoquímica de mieles comercializadas en la provincia de Mendoza (Argentina)
7 Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1
meq/kg), aunque el 35 % de las muestras presentaron un
contenido de acidez libre mayor que el establecido por
CAA.
Los valores promedios de acidez total y lactónica son
respectivamente 36,205 meq/kg y 10,295 meq/kg y
respecto al pH se presentó un valor promedio de 3,83
con límites mínimos y máximos de 3,11 y 5,07
respectivamente, siendo rangos muy amplios.
En todo el rango trabajado no se visualizó ninguna
efervescencia o proceso fermentativo que indicara una
relación con los altos niveles de acidez, aunque
objetivamente no se descarta la posibilidad.
Dada dicha acidez se estima que posiblemente esté
relacionada con un alto contenido de ácidos presentes en
los frutos de la Vitis vinifera, fundamentalmente por el
ácido tartárico y otros ácidos presentes en menor
proporción. Es común que las abejas acudan a los
viñedos, por la gran oferta y presencia de dichos frutos
en la provincia, en momentos donde el grano presenta
una exposición al medio de sus jugos celulares debido,
por ejemplo, a granizo. Ciertamente una fruta ofrece una
gran cantidad de componentes útiles para la dieta de la
abeja, como son los glúcidos y el aporte de agua
(Shackleton et al, 2016). En regiones como podría ser la
de Mendoza, en donde por ciertos periodos no abundan
vegetaciones que aporten néctar, las abejas pecoreadoras
podrían asistir a viñedos donde los frutos puedan
aportarles su jugo celular.
No se han encontrado reportes de investigaciones
respecto a esta posibilidad en la región, por lo que
resulta necesario continuar con estudios que permitan
postular con mayores certezas la influencia de este
cultivo en las mieles provinciales.
En cuanto al contenido promedio de
hidroximetilfurfural (16,56±19,21 mg/kg) se encuentra
por debajo del máximo establecido (40 mg/kg).
Particularmente se denotan valores superiores a los
permitidos por la legislación actual en casos del
contenido de HMF, indicador principal del
envejecimiento y frescura del alimento. El 6,6 % de las
muestras del rango en estudio presentaron un valor
superior a 40 ppm de HMF, máximo establecido por
CAA; siendo este un dato no menor ya que todo el rango
de muestras comprendido en este estudio pertenece a
mieles que se encontraban disponibles para consumo
directo, es decir, mieles que estaban ya en la fase final
de la cadena productiva.
Ciertamente a medida que pasa el tiempo y por más
que las condiciones de almacenamiento sean las ideales,
el contenido de HMF en las mieles aumentará
progresivamente. Mieles que no hayan tenido una
adecuada manipulación tecnológica durante su cadena
de valor y en aquellas etapas de riesgo proclives a la
generación del compuesto aldehídico no fueran
correctamente controladas, desembocará
inevitablemente en la generación y aumento acelerado
en su concentración de HMF.
Las temperaturas de almacenamiento entre 8 ºC y 35
ºC no afectan significativamente los parámetros como
pH, acidez libre y nitrógeno total pero sí influyen sobre
la producción de HMF y afectan el color, la actividad
diastásica y el contenido de prolina de las mieles
(Ordoñez de Yapur, 2004). Es necesario disminuir y
controlar exhaustivamente toda aquella operación que
involucre calentamiento directo o indirecto de la miel,
con el fin de minimizar la formación de HMF (Jeuring
& Kuppers, 1980).
A través de diversos procesos defectuosamente
ejecutados en cosecha y post cosecha, la miel puede
sufrir un decremento en su calidad. Por esto mismo los
estándares internacionales y en especial la legislación
argentina, fija los criterios fisicoquímicos y
organolépticos pertinentes para garantizar al
consumidor un alimento de óptima calidad.
La actividad de las diastasas se encuentra dentro de
los parámetros legislados en promedio
(31,97±21,81°Gothe). El 15 % de las muestras en
estudio presentaron una actividad inferior a 8 °Gothe,
mínimo establecido por CAA; dato no menor ya que
dichas mieles se corresponden para venta directa.
Un estudio sobre el comportamiento de la miel en
panal adecuada tecnológicamente en recinto
calefaccionado para facilitar procesos de extracción a
temperaturas cercanas a los 40 °C durante distintos
periodos de tiempo demostró que las temperaturas
implementadas en tales procesos influyen en un
incremento del contenido de HMF y una disminución
del contenido diastásico, presentando una correlación
entre ambos parámetros de R2 = 0,9167. Esto demuestra
la importancia del control de tales variables cuando la
miel se somete a temperaturas mayores a las
ambientales con un fin tecnológico, aplicable a procesos
como la pasteurización (Sanchez Mantica et al., 2021).
Respecto al color, las muestras de miel presentaron
una coloración promedio dentro del rango Ámbar claro
(50,0 a 84,9 mm) según la escala internacional Pfund.
Es destacable que, aunque el promedio se corresponde a
dicha categoría, el abanico de colores presentado por las
muestras es amplio y está relacionado a su origen
geográfico (Tabla 3).
En la comparación de medias entre zonas, se observa
que hay diferencias significativas en los parámetros de
humedad, sólidos insolubles, acidez lactónica, actividad
diastásica, hidroximetilfurfural y color (Tabla 3). La
E. Caliguli et al.
Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 8
influencia de la flora apícola, el medio ambiente, las
prácticas habituales del apicultor (especialmente
respecto a sólidos insolubles) y la situación geográfica,
en las características intrínsecas de la miel, pueden ser
motivo de las diferencias encontradas entre las zonas de
la provincia. Respecto a los datos obtenidos de acidez
lactónica, éstos pueden estar influenciados por muestras
que presentaron valores elevados de acidez libre,
alejándose de los valores promedio.
CONCLUSIONES
En cuanto a las variables fisicoquímicas, se
presentaron diferencias significativas entre zonas
productoras de la provincia de Mendoza para los
parámetros humedad, sólidos insolubles, acidez
lactónica, actividad diastásica, hidroximetilfurfural y
color.
Se observaron valores elevados en el rango de
muestras, superiores a lo estipulado en la normativa
nacional vigente, para los parámetros HMF y acidez
libre e inferiores para ID.
El contenido elevado de acidez libre encontrado en
un 35 % de las muestras analizadas destaca la necesidad
de realizar estudios analíticos específicos, y a su vez
determinar si existe influencia del medio respecto a tal
variable.
Se detectaron valores altos respecto a cenizas y color
en las muestras estudiadas, razón por la cual será
relevante continuar con estudios específicos para
identificar y caracterizar mielatos en las mieles
provinciales y determinar su posible relación con dichas
variables.
FINANCIAMIENTO
Este trabajo fue financiado por la Obra de Don
Bosco sede Rodeo del Medio, Mendoza Argentina; en el
marco del Proyecto de Investigación en Miel
desarrollado en el Centro de Investigación, Desarrollo,
Extensión y Servicios "Padre Francisco Oreglia"
(perteneciente a dicha institución).
DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE
INTERESES
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
AGRADECIMIENTOS
Debemos expresar un especial agradecimiento a
todos los colaboradores, especialistas consultados,
agentes de organismos e instituciones de ciencia y
tecnología y productores apícolas por sus aportes
invalorables para el desarrollo del proyecto.
Nuestra gratitud al Centro de Investigación
Desarrollo, Extensión y Servicios "Padre Francisco
Oreglia" de la Facultad Don Bosco de Enología y
Ciencias de la Alimentación, Universidad Católica de
Cuyo y a la Obra Don Bosco de Rodeo del Medio,
Mendoza, Argentina, por constituir los canales
institucionales que facilitaron los medio y los recursos,
para llevar a cabo el trabajo de investigación propuesto.
Zona
Azúcares
reductores
%
Sacarosa
aparente
%
Humedad
%
Cenizas
%
Sólidos
insolubles
en agua %
Acidez
libre
meq/kg
Acidez
lactónica
meq/kg
Acidez
total
meq/kg
pH
ID
°Gothe
HMF
mg/Kg
Color
(mm)
Gran
Mendoza
72,128 a
1,271 a
17,150 a
0,441 a
0,089 b
43,389 a
8,258 b
51,647 a
3,813 a
18,028 b
28,494 a
91,500 a
Oasis
Sur
71,010 a
1,034 a
16,308 ab
0,507 a
0,227 a
46,602 a
7,919 b
54,520 a
3,839 a
22,873 b
21,876 ab
76,875 ab
Oasis
Norte
72,354 a
1,441 a
15,617 b
0,303 a
0,047 b
35,031 a
10,725 ab
45,755 a
3,995 a
30,628 ab
14,999 ab
73,875 ab
Oasis
Este
73,003 a
1,708 a
16,075 ab
0,183 a
0,056 b
27,463 a
13,039 a
40,503 a
3,695 a
49,230 a
7,198 b
50,083 b
Valle
de Uco
69,168 a
1,107 a
15,917 b
0,367 a
0,142 ab
28,542 a
11,533 ab
40,068 a
3,805 a
39,104 ab
10,247 ab
72,167 ab
Pr >
F(Modelo)
0,303
0,139
0,004
0,089
0,000
0,053
0,004
0,277
0,266
0,002
0,038
0,023
Significativo
No
No
Sí
No
Sí
No
Sí
No
No
Sí
Sí
Sí
Tabla 3. Contraste de medias de variables fisicoqumicas de muestras de miel de Mendoza (Argentina).
Evaluación fisicoquímica de mieles comercializadas en la provincia de Mendoza (Argentina)
9 Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1
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Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 10
Derechos de Autor (c) 2022 Elena E. Caliguli, Laura V. Arévalo, Liliana E. Tonini, Alejandra Grosso,
Damián G. Sanchez Mantica
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EUNK - Revista Científica de Abejas y Apicultores
Editorial EUNK
www.eunk.org
ISSN en línea: 2953-3740
Volumen 1 (2022), Número 1
https://doi.org/10.52559/eunk.v1i1.23
ARTÍCULO ORIGINAL
Impacto de la polinización entomófila en la producción de semilla de
trébol rojo, Trifolium pratense L. (Fabaceae) en Bahía Blanca,
Argentina
Soledad C. Villamil1, Luciano A. Marinozzi1,2, Facundo Ess3
1 Laboratorio de Estudios Apícolas (LabEA), Departamento de Agronomía Universidad Nacional del Sur – CIC.
2 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).
3 Departamento de Agronomía, Universidad Nacional del Sur.
E-mail de contacto: S. Villamil, soledad.villamil@uns.edu.ar
Recibido: 22 febrero 2022; aceptado: 1 junio 2022; publicado: 30 junio 2022
Resumen
En 2017, se dividieron plantas de trébol rojo (genotipo TRG), Trifolium pratense L. (Fabaceae), en tres tratamientos de polinización
entomófila (Bombus pauloensis, Apis mellifera, polinización libre) y un testigo sin polinización entomófila. Se utilizaron 16 parcelas
y jaulas que contenían 40 individuos de B. pauloensis o núcleos de cuatro cuadros de A. mellifera; la jaula de exclusión no tenía
insectos. Se colocaron trampas de agua en las parcelas de polinización libre. Una vez cosechado, se determinó número y peso de
semillas por planta. La longitud de proboscis medida para Apis (5,02 mm) fue menor (p<0,0001) que la de Bombus (7,60 mm) que,
además, supera la corola del trébol rojo (7,00 mm). Las trampas mostraron la casi ausencia de polinizadores naturales en el ambiente.
Bombus pauloensis logró alto rendimiento de trébol rojo (113 mg semilla/planta); pero, el logrado con Apis (57 mg semilla/planta) no
es despreciable.
Palabras clave: Apis mellifera, Bombus pauloensis, polinización de cultivos, trébol rojo, Trifolium pratense.
Impact of insect pollination on seed production of red clover, Trifolium pratense L.
Abstract
In 2017, red clover, Trifolium pratense L., plants (genotipo TRG) were divided into three insect pollination treatments (Bombus
pauloensis, Apis mellifera, open pollination) and a control without insect pollination. Sixteen plots were used and cages with 40 B.
pauloensis individuals or 4-frame A. mellifera nucs; the exclusion cage contained no insects. Water traps were deployed in open
pollination plots. Once harvested, number and weight of seeds per plant were determined. Probosces measured for Apis (5,02 mm) was
shorter (p<0,0001) than Bombus (7,60 mm) which also surpassed red clover corolla length (7,00 mm). Traps showed the almost
complete absence of pollinators in the environment. Bombus pauloensis achieved high yields of red clover (113 mg seeds/plant); but
yields achieved by Apis (57 mg seeds/plant) should not be disregarded.
Key words: Apis mellifera, Bombus pauloensis, crop pollination, red clover, Trifolium pratense.
INTRODUCCIÓN
El trébol rojo, Trifolium pratense L. (Fabales:
Fabaceae), es una planta perenne nativa de Eurasia y
África que posee, como muchas otras especies de la
misma familia, buena calidad de forraje por su elevado
contenido de proteínas y digestibilidad, además de la
capacidad de fijar nitrógeno atmosférico. En la región
pampeana, en general su producción disminuye mucho
luego del segundo año, lo que lo hace apto para
rotaciones cortas. En siembras consociadas con
gramíneas u otras fabáceas, también produce altos
S. Villamil et al.
Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 12
volúmenes de forraje en el primer ciclo de crecimiento,
característica que justifica su inclusión en mezclas
forrajeras de rotación corta. Varios factores pueden
afectar la persistencia potencial de la especie, como
enfermedades, desórdenes fisiológicos, plagas, manejo
de la defoliación y ciclo de la planta (Barletta et al.,
2013; INIA, 2017).
La presencia de insectos polinizadores resulta
indispensable para la producción de semilla de trébol
rojo debido a la autoesterilidad de este cultivo (Darwin,
1871). Los principales órdenes de insectos polinizadores
son Diptera, Coleoptera, Hymenoptera y Lepidoptera
(Kevan, 2008). Según Carámbula (1981), la búsqueda
de polinizadores eficientes para el trébol rojo ha dado
lugar a numerosos trabajos donde se destaca la
importancia relativa de cada uno. Sin embargo, además
de Apis mellifera y de los abejorros del género Bombus,
son pocos los insectos capaces de polinizar este cultivo
(Arretz & Macfarlane, 1986; Free, 1993; Nates-Parra,
2005; Rao & Stephen, 2009; Salvarrey et al., 2017), ya
que muchos no tienen la proboscis lo suficientemente
larga como para acceder a los nectarios ubicados en el
fondo del tubo floral. Si bien se discute la habilidad de
la abeja melífera (A. mellifera) para polinizar el trébol
rojo, se han demostrado incrementos en el rendimiento
de semillas cuando se colocan colmenas de éstas en el
cultivo (Forster & Hadfield, 1958; Palmer-Jones et al.,
1966; Free, 1993). Para la producción de semillas en un
forraje, se busca lograr una polinización rápida que evite
que la floración se extienda en el tiempo y así promover
mayor uniformidad al momento de la cosecha. Además,
se disminuye el riesgo de exposición de la semilla a
plagas, enfermedades, condiciones climáticas
desfavorables, productos agroquímicos y se ahorra en
agua (Kluser et al., 2010).
Todavía no existe en la generalidad de los
productores una conciencia sobre el riesgo que conlleva
la merma y escasez de polinizadores, ni se cuenta con
información científica regional sobre las poblaciones de
especies silvestres (Kremen, 2005; Hederström et al.,
2021; Jing et al., 2021a,b). Reclamar el reconocimiento
de la apicultura como servicio de polinización y
preservar a otros polinizadores requiere un soporte
técnico que demuestre su importancia económico-
productiva y ambiental, además de fundamentar
técnicas de manejo y políticas públicas. Los objetivos
del trabajo fueron determinar si existen diferencias entre
la producción de semillas de T. pratense (genotipo TRG)
utilizando cuatro diferentes escenarios de polinización e
identificar en cuál de ellos se logra el mayor rendimiento
de semilla. Los cuatro tratamientos fueron polinización
con Bombus pauloensis (PB), polinización con Apis
mellifera (PA), polinización libre por polinizadores
silvestres (PL) y polinización restringida sin insectos
polinizadores (PR). Se esperaba que, al igual que
muchos otros cultivares de trébol rojo, la producción de
semilla por autofecundación de este genotipo fuera muy
baja comparada con la obtenida por fecundación
entomófila. También se esperaba que la producción de
semillas lograda mediante polinización por B.
pauloensis (=B. atratus; véase Moure & Melo, 2012),
fuera la más alta. Además, se quería determinar si era
posible que Bombus bellicosus Smith, la única especie
silvestre de este género en la zona, utilizaría al trébol
rojo como recurso.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se trabajó con T. pratense, genotipo TRG, de la
empresa Gentos SA (Pergamino, Buenos Aires,
Argentina). Se sembraron plantineras en invernáculo en
dicha ciudad, el 7 de marzo de 2017, utilizando inóculo
específico. El 20 de septiembre de 2017, se
transportaron al predio del Departamento de
Agronomía, Universidad Nacional del Sur, Bahía
Blanca. Seis días después, se trasplantaron
individualmente a macetas de 5 litros y se continuó el
desarrollo de las plantas a campo con riego manual. Se
aplicó fertilizante granulado “Triple 15” (15% N; 15 %
P2O5; 15% K2O) los días 9 de noviembre de 2017 y 6 de
diciembre de 2017. El 26 de diciembre, el material en
flor se dispuso en parcelas de 19 plantas cada una.
Aunque no se registró la flora circundante, se
observaron ejemplares en flor de Diplotaxis tenuifolia,
Raphanus sativus, Scabiosa atropurpurea como
espontáneas y Lavandula angustifolia, Solanum
lycopersicon y Cucurbita máxima variedad zapallito de
una huerta aledaña.
En este experimento se aplicaron cuatro tratamientos
de polinización con cuatro réplicas cada uno (= 16
parcelas), con distribución aleatoria en un área de 6 m x
12 m en dos hileras de ocho jaulas. Los tratamientos se
llevaron a cabo en jaulas de exclusión de 2 m x 1 m x
1,5 m con estructura de polipropileno y malla antiáfido,
excepto en el caso de Polinización Libre (sin jaula) ya
que permite las visitas de todos los polinizadores
presentes en el ambiente. Para el tratamiento con A.
mellifera, se colocó dentro de la jaula la menor unidad
funcional utilizable: un núcleo de abejas compuesto por
un cuadro de cría operculada, dos cuadros de cría abierta
y uno con reservas de miel y polen. Los cuadros de cría
estaban cubiertos por abejas adultas, además de una
reina en producción. En el caso de B. pauloensis, se
utilizó una colonia comercial de Biobest S.A. (Burzaco,
Impacto de la polinización entomófila en la producción de semilla de trébol rojo, Trifolium pratense L. (Fabaceae)
13 Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1
Buenos Aires, Argentina) de unos 40 individuos por
jaula. En el tratamiento testigo (Polinización
Restringida) se aseguró la ausencia de polinización
entomófila utilizando una jaula para la exclusión de todo
tipo de polinizadores.
Los tratamientos de polinización se aplicaron desde
la colocación de las jaulas el 28 de diciembre de 2017
hasta el retiro de los polinizadores comerciales
utilizados el 23 de enero de 2018 (período que abarcó la
floración del cultivo). A partir de esta última fecha hasta
la cosecha, se continuó regando y desmalezando. En las
parcelas de PA y PB, se abrieron las mallas antiáfidos
cuando finalizó la floración. Las jaulas de PA y PB se
retiraron el 1 de febrero de 2018, usándolas hasta esa
fecha para mantener un sombreado similar a las parcelas
de PR, las que conservaron las mallas antiáfidos
cerradas hasta el momento de la cosecha.
Durante el período de ensayo, se colocaron trampas
de agua en las cuatro parcelas de Polinización Libre, a
fin de capturar los insectos visitantes. Estas trampas se
colocaron en seis fechas: 11, 12, 14, 19, 20 y 21 de enero
y consistieron en vasos de plástico blancos (Marinozzi
et al., 2018; Boyer et al., 2020) de 180 ml con 100 ml
de agua y unas gotas de detergente sin perfume para
romper la tensión superficial y evitar que los insectos
escapen. Los vasos se colocaron de a dos por parcela, a
la altura de las flores. Las trampas se revisaron 24 h
después de colocadas y los insectos atrapados fueron
llevados al laboratorio y conservados en freezer hasta el
momento de su identificación y recuento. Para los
ejemplares dudosos o desconocidos se utilizaron claves
entomológicas (Michener et al., 1994; Michener, 2007;
Roig-Juñent et al., 2014), además de consultar con
especialistas del Museo
Argentino de Ciencias Naturales “Bernardino
Rivadavia”.
Para determinar el largo de la proboscis, se midió el
largo de varias de sus piezas como el prementón, los
palpos labiales derecho e izquierdo y la glosa (Medler,
1962) de 16 ejemplares de B. pauloensis de los nidos
comerciales y de 16 ejemplares de A. mellifera. No se
midieron ejemplares silvestres de B. pauloensis porque
no los hay en la zona donde se realizó el ensayo. La
proboscis de cada individuo se estiró sobre papel y se
midió con el calibre digital.
Se utilizó el software Infostat (Di Rienzo et al.,
2018) para realizar los análisis estadísticos realizados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De las 19 plantas originales por parcela, se utilizaron
12 a fin de balancear los análisis estadísticos por pérdida
de plantas. Los análisis de varianza realizados mostraron
que el tratamiento con B. pauloensis mostró los mayores
valores respecto al número y peso de semillas por planta,
diferenciándose significativamente de los demás. El
tratamiento con A. mellifera obtuvo menores valores de
número y peso de semillas por planta que el tratamiento
con B. pauloensis y se diferenció estadísticamente del
mismo. Los tratamientos de Polinización Libre y
Polinización Restringida no se diferenciaron
estadísticamente entre sí (Tab. 1).
Dada la escasa cantidad de plantas que produjeron
semillas, no se pudo realizar un análisis estadístico sobre
el peso por semilla de los tratamientos de Polinización
Libre y Restringida (Fig. 1). El peso por semilla de los
tratamientos B. pauloensis y A. mellifera fue el mismo
(1,8 mg); por lo tanto, el factor que marcó la diferencia
de rendimiento fue el número de semillas obtenidas
(Tab. 2).
Teniendo en cuenta varios de los componentes de
rendimiento medidos (como peso y número de semilla)
se puede inferir que el rendimiento de las parcelas
polinizadas por B. pauloensis fue significativamente
mejor (p<0,05) que el de A. mellifera, lo que coincide
con los resultados obtenidos previamente
(Vanommeslaeghe et al., 2018; Hederström et al., 2021;
Jing et al., 2021a,b). Abejas solitarias, abejas melíferas
Tabla 1. Medias del número y peso de semillas por planta de trébol rojo, Trifolium pratense, utilizando diferentes tratamientos de
polinización.
Tratamiento de polinización
Número de semillas/planta
Peso de semillas/planta (mg)
Restringido
4.7 a
9.4 a
Libre
4.9 a
9.4 a
Apis
30.6 b
56.6 b
Bombus
63.8 c
113.3 c
*Medias de una misma columna con una misma letra no son significativamente diferentes (p < 0.05) LSD Fisher.
S. Villamil et al.
Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 14
y abejorros se reconocen como potenciales
polinizadores del trébol rojo (Arretz & Macfarlane,
1986; Rao & Stephen, 2009; Salvarrey et al., 2017),
resultando las especies de abejorros del género Bombus
las más importantes para esta función en la mayoría de
los trabajos de investigación. Las parcelas de PL no
resultaron en una buena producción de semilla, por lo
que se desprende que Bahía Blanca no tuvo una fauna
entomológica suficiente o adecuada para este propósito.
Esto no es sorprendente ya que la única especie de
Bombus presente en la zona es B. bellicosus
(Abrahamovich et al., 2007) y, en todo el ensayo, sólo
se observó un ejemplar pecoreando el cultivo.
El abejorro utilizado en este ensayo, B. pauloensis,
pertenece a una de las especies del género con proboscis
mayor a 7 mm, longitud considerada suficiente para
alcanzar el néctar de trébol rojo (Holm, 1966). En todos
los casos, las piezas bucales medidas pertenecientes a B.
pauloensis fueron más largas y se diferenciaron
significativamente (p<0.0001) de las de A. mellifera
utilizando un análisis de varianza y comparación de
medias por LSD Fisher. Específicamente, sumando los
valores de prementón y glosa se obtuvo 7,6 ± 1,4 mm
para los abejorros y 5,0 ± 0,3 mm para las abejas. La
longitud de proboscis de los insectos evaluados coincide
con los antiguos estudios de Darwin (1871) quien
demostró que el género Bombus era el más adecuado
para la polinización de trébol rojo por su longitud de
proboscis. Arbulo et al. (2011) obtuvieron valores de 8,4
± 0,65 mm en sus mediciones de proboscis de
ejemplares silvestres de B. pauloensis en Uruguay. Esta
diferencia de longitud de proboscis entre los abejorros
comerciales y una población natural podría deberse a
presión de selección en el proceso de domesticación
(Mortensen et al., 2019).
Trampas para polinizadores
Durante las fechas de floración del cultivo se
observaron pocos insectos volando a distintas horas del
día tanto en el cultivo como en la flora circundante. Las
capturas de polinizadores por trampas de agua colocadas
en las parcelas de Polinización Libre resultaron escasas.
En total, se capturaron 75 insectos.
El 94,7% de los insectos capturados pertenecían a
uno de los tres órdenes más importantes entre los
polinizadores: Diptera, Coleoptera o Hymenoptera
(Tab. 3). Sin embargo, los valores resultaron bajos en
todos los muestreos realizados, lo que refuerza la
importancia de la polinización entomófila ya que las
parcelas de Polinización Libre tuvieron un rendimiento
de semilla muy bajo.
Tabla 2. Peso por semilla (mg) obtenido en distintos tratamientos de polinización de trébol rojo, Trifolium pratense.
Tratamiento de polinización
Peso/semilla (mg)
Restringido
2.1
Libre
1.9
Apis
1.8
Bombus
1.8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Apis Bombus Restringido Libre
% plantas
CON semilla SIN semilla
Figura 1. Porcentaje de plantas CON y SIN semilla por tratamiento de polinización en trébol rojo, Trifolium pratense.
Impacto de la polinización entomófila en la producción de semilla de trébol rojo, Trifolium pratense L. (Fabaceae)
15 Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1
CONCLUSIONES
Uno de los objetivos del estudio fue la determinación
de diferencias en la producción de semillas de trébol rojo
utilizando diferentes escenarios de polinización. El
ensayo permitió identificar que B. pauloensis es, entre
los polinizadores testeados, el más eficiente para T.
pratense (genotipo GTR). La posibilidad de utilizar A.
mellifera para la polinización de trébol rojo no debe ser
inmediatamente descartada por el productor ya que,
aunque no es tan eficiente para el cultivo como B.
pauloensis, aumenta significativamente el rendimiento.
Además, al ser una especie muy difundida en el medio
agrícola, facilita enormemente la logística del servicio
de polinización. Las parcelas de PR o PL prácticamente
no produjeron semilla; es decir que la autofecundación
fue mucho menor que la lograda por polinización
entomófila. Esto también indica que la entomofauna
silvestre de Bahía Blanca no es la adecuada para la
producción de semilla de trébol rojo.
FINANCIAMIENTO
Este trabajo fue financiado por la empresa Gentos S.
A., por el PGI 24/A218 otorgado por la Universidad
Nacional del Sur y por una beca de grado EVC CIN para
F. Ess.
DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE
INTERESES
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Dra. Rosa Jáuregui por proponer
la realización del ensayo y a Gentos S.A. por los fondos
y el material vegetal; a la Comisión de Investigaciones
Científicas (CIC) por los subsidios de funcionamiento
de centros asociados y al Departamento de Agronomía,
Universidad Nacional del Sur por los Proyectos de
Grupos de Investigación. Estamos muy agradecidos a
los tres revisores anónimos cuyas críticas fueron muy
superadoras para la mejora de este trabajo. Finalmente,
agradecemos a los integrantes del Laboratorio de
Estudios Apícolas (LabEA) por colaborar cuando fue
necesario y por brindar un excelente ambiente de
trabajo.
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Tabla 3. Capturas en trampas de agua en trébol rojo, Trifolium pratense: D: Diptera, C: Coleoptera, H: Hymenoptera, DCH: Diptera
+ Coleoptera + Hymenoptera.
Órdenes
D±DS
C±DS
H±DS
Otros±DS
Total±DS
Total DCH±DS
Total*
28
2
41
4
75
71
Media
1,6±0,9
1,0± 0,0
1,6±0,8
1,0±0,0
2,4±1,2
2,3±1,2
n trampas
17
2
26
4
36
31
% del Total
37,3
2,7
54,7
5,3
100,0
94,7
% de DCH
39,4
2,8
57,7
100,0
S. Villamil et al.
Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 16
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Derechos de Autor (c) 2022 Soledad Villamil, Luciano A. Marinozzi, Facundo Ess
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EUNK - Revista Científica de Abejas y Apicultores
Editorial EUNK
www.eunk.org
ISSN en línea: 2953-3740
Volumen 1 (2022), Número 1
https://doi.org/10.52559/eunk.v1i1.24
ARTÍCULO ORIGINAL
Effects of dietary supplementation with abscisic acid on Apis mellifera
colonies confined in overwintering nucleus: studies on the adult honey
bee population, nosemosis, and expression of nutrition- and
immune-related genes
Nicolás Szawarski1, Enzo Domínguez1,2, Silvina Quintana1,2,4, Gregorio De Landa1,2, Constanza Brasesco1,2, Facundo
Meroi Arcerito1,3, Eugenia Olivera 1, Giulia Mitton1,2, Facundo Ramos1,3, Martín Javier Eguaras1,2, Lorenzo Lamattina5
and Matías Maggi1,2
1 Centro de Investigacin en Abejas Sociales (CIAS). Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP), Mar del Plata, Argentina.
. 2 Instituto de Investigaciones en Producción Sanidad y Ambiente (IIPROSAM), Centro Científico Tecnológico Mar del Plata, CONICET.
Centro de Asociación Simple CIC PBA, Argentina.
3 Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Buenos Aires, Argentina.
4 Laboratorio de Biología Molecular, Farestaie, Argentina.
5 Instituto de Investigaciones Biológicas (IIB-CONICET), Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina.
*Corresponding author: N. Szawarski, n.szawarski@gmail.com
Received: 11 May 2022; accepted: 8 June 2022; published: 30 June 2022
Abstract
Due to the complex interactions between pathogens and environmental and anthropogenic stressors, in temperate climates, honey bee
populations suffer depopulation and/or colony death, mainly during overwintering. Nosema spp. comprises one of the primary
pathogens affecting Apis mellifera colonies, and cold ambient temperature promotes its intensity in worker bees. Additionally, the
drastic reduction of plants decreases the diversity and quality of pollen and nectar diet for bees, leading to malnutrition of honey bee
colonies and compromising the immunity of individuals, increasingly vulnerable to parasites and pathogens. Previous studies showed
that abscisic acid (ABA) stimulates the health of honey bees at individual and colony levels against different stress conditions. This
study aimed at evaluating the effect of supplementing the diet with ABA on overwintering nuclei, considering the population growth
of honey bee colonies, nosemosis dynamics, and the nutrition- and immune-related gene expression of honey bees. Results in this work
showed that ABA had no significant effect on any of the parameters studied. However, taking into account the results observed in the
variables measured, we encourage the development of more studies focused on this topic, using more colonies per group and measuring
the blooming period and the plant species involved.
Key words: Apis mellifera; abscisic acid; nosemosis; gene expression
Efectos de una dieta suplementaria con ácido abscísico en núcleos de Apis mellifera durante el
invierno: estudios sobre la población de abejas adultas, nosemosis y la expresión de genes
relacionados con la nutrición y el sistema inmunológico
Resumen
Debido a las complejas interacciones entre diversos estresores, en climas templados las poblaciones de abejas melíferas sufren
despoblaciones y/o mortalidad, principalmente durante el invierno. Nosema spp. se encuentra entre los principales patógenos que
afectan a las colonias de Apis mellifera y es durante el invierno donde se han registrado valores altos del desarrollo de esta enfermedad
en las abejas obreras. Además, la reducción de la diversidad vegetal disminuye la cantidad y la calidad de la dieta de polen y néctar, lo
que lleva a la malnutrición de las colonias de abejas. Estudios anteriores demostraron que el ácido abscísico (ABA) estimula la salud
de las abejas melíferas frente a diferentes condiciones de estrés. En este contexto, el objetivo principal de este estudio fue evaluar el
efecto de la suplementación del alimento con ABA durante el invierno en núcleos de abejas melíferas considerando el desarrollo de la
N. Szawarski et al.
Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 18
población, la dinámica de la nosemosis y la expresión génica relacionada con la nutrición y la inmunidad. Los resultados obtenidos en
este trabajo mostraron que ABA no tuvo un efecto significativo en ninguno de los parámetros estudiados. Sin embargo, teniendo en
cuenta los resultados observados, consideramos profundizar los estudios enfocados en esta temática, utilizando un mayor número de
colonias por grupo y midiendo los periodos de floración y las especies de plantas involucradas.
Palabras clave: Apis mellifera; ácido abscísico; nosemosis; expresión génica
INTRODUCTION
The conventional agricultural production system
adopted as a standard practice worldwide is currently
leading to the loss of biodiversity (Eardley et al., 2016)
due to changes in land management, land cover and
configuration, and agrochemical use (such as herbicides,
fungicides, and insecticides) linked to these intensive
production models (Dicks et al., 2021). Consequently, a
decline in some wild and managed pollinators in several
world regions is evident (Potts et al., 2010; Koh et al.,
2016; Requier et al., 2018). Bee populations comprise
around 20,000 species with diverse life forms and
habits, fulfilling a fundamental role in ecosystems
through plant pollination (Eardley et al., 2016).
The European honey bee Apis mellifera is one of the
few bees exploited by humans for commercial purposes.
Although beekeepers are yearly multiplying bee hives to
recover loss and/or increase them for productive
purposes, a decrease in honey bees has been recorded in
some regions (Meixner, 2010; vanEngelsdorp et al.,
2012; Requier et al., 2018). Several factors have been
identified as the main drivers of the loss and
depopulation of honey bees (Steinhauer et al., 2018).
Reports show that the interaction between pathogens
and environmental and anthropogenic stressors are
acting synergistically to negatively impact honey bee
populations (DeGrandi-Hoffman & Chen, 2015;
Steinhauer et al., 2018).
Main pathogens affecting the population dynamics
of A. mellifera colonies include the intracellular parasite
Nosema spp. (Higes et al., 2008). Nosema apis and
Nosema ceranae are the etiological agents of nosemosis
(Higes et al., 2008; Fries et al., 2013). Recently, the
genera Nosema and Vairimorpha have been renamed as
N. ceranae and N. apis as Vairimorpha ceranae and
Vairimorpha apis, respectively (Tokarev et al., 2020).
Nevertheless, in the present report, and to avoid any
confusion, we will keep the traditional classification.
Nosema infections negatively impact colony strength
and productivity (Botías et al., 2013). However, N.
ceranae infections have been reported to be more severe
in honey bee colonies than N. apis infections (Higes et
al., 2008). In Argentina, genetic studies reported that the
cosmopolite microsporidia species is N. ceranae
(Medici et al., 2012; Porrini et al., 2020). In addition,
other studies have concluded that nosemosis can act
synergistically with other risk factors (Steinhauer et al.,
2018). For example, in temperate climates like that in
Argentina, the cold ambient temperature promotes
Nosema spp. intensity in honey bee workers (Retschnig
et al., 2017).
The drastic reduction of wild and native grasslands
is probably one of the most critical ecological
consequences arising from conventional agriculture,
decreasing the diversity and quality of pollen and nectar
diet for bees (Eardley et al., 2016). This decrease
produces malnutrition in honey bee colonies,
compromising the immunity of individuals and turning
bee populations more vulnerable to parasites and
pathogens (DeGrandi-Hoffman & Chen, 2015; Negri et
al., 2019). Thus, honey bee colonies growing in
temperate climates with reduced flower resources are
doubly challenged by cold stress and malnutrition (Döke
et al., 2015; Steinhauer et al., 2018).
In Argentina, the growth of monocultures is
significant, particularly soybean. Since 1996, this crop
has continuously replaced natural extensions of habitats,
affecting plant diversity and, consequently, pollen and
nectar available to honey bees. Recently, a study also
reported a reduction in honey yield of ~60 % in colonies
associated with soybean crops (de Groot et al., 2021).
The advance of monocultures, the loss of floral
resources, and the impact of cold climates induce
beekeepers to adopt standard practices after the honey
harvest season, such as supplementary energetic feeding
of their colonies (sugar syrup, usually sucrose: water
2:1) to meet the energetic requirements overwintering.
However, this supplement has low nutritional value
compared to that of honey (Wheeler & Robinson, 2014),
providing only a carbohydrate source. By contrast,
honey is a natural food mainly derived from nectar and
a highly nutritious source that provides natural and
diversified sugars and low levels of minerals, amino
acids, proteins (Erler & Moritz, 2016), molecules acting
as secondary metabolites (phenolic acids, terpenes,
alkaloids, etc.), and phytohormones (Wang et al., 2017;
Akšić et al., 2020). Research shows that such natural
molecules in nectar, pollen, and resins have beneficial
effects on the health of honey bees, associated with the
concept of self-medication (Erler & Moritz, 2016).
Examples of these molecules include p-coumaric acid
Effects of dietary supplementation with abscisic acid on Apis mellifera colonies confined in overwintering nucleus
19 Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1
(phenolic acid), abscisic acid (sesquiterpenoid
hormone), anabasine (alkaloid), catalpol
(monoterpenoid), quercetin (flavonol), nicotine
(alkaloid), and thymol (terpenoid) (Bernklau et al.,
2019; Negri et al., 2019; Mitton et al., 2020).
In recent years, our research group has focused on
the role of phytohormone abscisic acid (ABA), reporting
favourable results on the health of honey bees at
different levels (individual and colony), under different
stress conditions (Negri et al., 2015; 2017; 2020). In
vitro-reared bee larvae exposed to cold stress and ABA
supplementation revealed that the phytochemical
induced the expression of several immune-related
genes, mainly those of the Toll and JAK/STAT
pathways, nitric oxide synthase (Negri et al., 2020), and
nutrition-related gen vitellogenin (Ramirez et al., 2017).
In field conditions, Negri et al. (2015) evaluated the
effects of ABA on the immune response of honey bees
and the performance of small A. mellifera colonies
throughout winter. Results demonstrated that ABA had
an effect at the individual level by stimulating innate
cellular and humoral responses, and at a colony level
where the group supplemented with ABA resulted in an
adult population of honey bees of approximately 70%
larger than the control group after winter (Negri et al.,
2015). Similarly, other studies have shown that the ABA
dietary supplementation in honey bee colonies kept in
Langstroth hives in combination with two different
beekeeping nutritional strategies to confront
overwintering, “honey management”, and “syrup
management” had positive effects on the population
dynamics. In such conditions, A. mellifera colonies
reached stable levels of adult bees, increased brood
during overwintering, and tended to prevent nosemosis
at the colony level (prevalence) (Szawarski et al., 2019).
The honey bee colonies supplemented with ABA
showed that the level of parasitized individuals did not
increase significantly in late winter, in contrast with the
control, which increased significantly (Szawarski et al.,
2019).
However, the effect of ABA on colonies of honey
bees integrated into nuclei during winter has not yet
been studied. The multiplication of honey bee colonies
by means of nuclei comprising three to five frames with
adults, brood, pollen, and honey reserves is a common
practice followed by beekeepers to replace or increase
the number of productive hives. Nevertheless,
considering the small population of these colonies,
beekeepers choose to produce them during the warmer
seasons, especially during spring. In this sense, the
growth and development of these colonies throughout
the summer avoid possible losses due to the cold
temperatures that characterize winter in temperate
climates.
Based on our previous reports, the main goal of this
study was to evaluate the effect of ABA
supplementation on overwintering nuclei colonies,
centred on the experimental design and the use of small
bee colonies (nucleus), to measure different biological
variables at colony and individual levels. Specifically,
we were interested in the impact of ABA
supplementation on: 1) the honey bee population
dynamics of nuclei from late summer that has to survive
winter (colony level); 2) Nosema spp. population
dynamics (colony level); and 3) the nutrition- and
immune-related gene expression (individual level).
Accordingly, we hypothesize that ABA
supplementation impacts positively colony strength,
Nosema spp. dynamics, and expression of nutrition- and
immune-related genes.
MATERIALS AND METHODS
Study location and biological material
The field trial was performed in the experimental
apiary belonging to the Social Bee Research Centre
(CIAS-IIPROSAM-UNMdP), at the Santa Paula farm
(38°10'06” S, 57°38'10” W), Mar del Plata, Buenos
Aires, Argentina. This study was carried out with a local
honey bee ecotype (A. mellifera carnica x A. mellifera
ligustica) (Giménez-Martínez et al., 2017). Queens
came from a mother colony at “Mar y Sierras”
beekeeping hut, at the Santa Paula farm, provided by Dr.
Leonardo De Feudis. Experimental units (honey bee
colonies) were assembled into a nucleus; each consisted
of three brood frames, one reserve frame (with honey
and pollen), a newly fertilized queen, and a large adult
bee population. They were prepared between February
and March 2017. A total of eight nuclei were used (4 per
treatment) following the Langstroth dimensions
associated with the production system. Before
beginning the trial, an acaricide treatment based on
oxalic acid (Aluen CAP®, Cooperativa Apícola
Pampero, Bahía Blanca, Argentina) was applied to the
honey bee colonies for varroosis control.
Phytochemical
(R,S)-abscisic acid (ABA) was purchased from
Sigma-Aldrich® (USA). The stock of ABA was
dissolved in absolute ethanol (≥ 99.5% V/V purity,
Biopack®) for the preparation of mother solution (50
mM). The final concentration of ABA dissolved in syrup
(2:1, sugar: water, v: v) was 50 μM. The concentration
N. Szawarski et al.
Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 20
of phytochemical ABA was defined according to the
concentrations found in honey, also reported as a driver
of physiological effects on the health of honey bees
(Ramirez et al., 2017; Szawarski et al., 2019).
Treatment
Each group consisted of four colonies integrated into
a honey bee nucleus plus a Doolittle feeder. The control
group was fed weekly with 500 ml of sugar syrup (2:1,
sugar: water, v:v) and the ABA group was fed weekly
with 50 μM ABA dissolved in 500 ml of sugar syrup
(2:1, sugar: water, v:v). Both diets (control or ABA
treatment) were supplied throughout the experiment
(autumn-winter). The study was performed from May
11(first day of application of the control and
phytochemical treatment, autumn) to September 19 (late
winter) 2017.
Population dynamics and survival of honey bee
colonies
As a parameter of the strength of colonies, the
number of combs covered by adult honey bees (defined
as "degree") was measured in each of these, according
to the subjective method (Delaplane et al., 2013). The
population degree of the honey bee colonies was used to
estimate the population size of adult individuals. To
measure this parameter, we quantified adult honey bees
covering the frames. Therefore, this variable was
defined as degree x = x comb covered by adult honey
bees.
Quantification of spores of Nosema spp. by
optical microscopy
Quantification of Nosema spp. was carried out
according to Fries et al. (2013). Samples from forager
bees were taken from every colony after each treatment:
(a) T1 time-point (May 17), (b) T2 time-point (August
5), and (c) T3 time-point (September 19). The entrance
of each hive was covered with rubber foam so that the
returning forager honey bees from the flight could
concentrate on entrance. For each hive, a representative
group of approximately 100 individuals was sampled
using a bottle with 70% ethanol. Forager bees were
sampled as they showed high infection levels compared
to those of younger bees. All samples were collected at
noon to compare time-points between treatments
(Meana et al., 2010). To determine the prevalence of
Nosema spp. (number of infected honey bees/number of
honey bees examined), 21 bees from each sample group
(per hive) were used. Their abdomen was dissected and
homogenized individually in 1 ml of distilled water. To
determine the abundance of Nosema spp. (n°
spores/bee), pools of 60 honey bees from each sample
group (per hive) were used. Their abdomen was
dissected, and with a mortar, they were homogenized in
60 ml of distilled water (in a ratio of 1 ml of
water/abdomen). The spore count of Nosema spp. was
performed using a Neubauer counting chamber
(BOECO, Germany) and an optical microscope
(LEYCA DM 500, Germany) (480X).
Molecular biology analysis
Sampling: For the determination of the gene
expression related to the immune system of A. mellifera,
samples of nurse bees were taken from the brood frames
(n = 15) (Steinman et al., 2015) in a winter time-point
(August 4). The sampling consisted of collecting nurses
individually with forceps in a single bag (with zip
closure, Ziploc® type), duly labelled for each colony,
and stored with dry ice (~ -70°C). These were then
transferred to a freezer at -80 °C until RNA extractions
were started.
RNA extraction: RNA was extracted from pools of
ten adult bees randomly selected from each sample,
according to Reynaldi et al. (2010) with modifications
(Brasesco et al., 2021). Bees were ground with a glass
rod and homogenized with 3 ml of phosphate buffer
saline free of RNases (1X PBS). The homogenate
obtained from each sample was centrifuged for 15 min
at 15,000 xg. Total RNA was extracted using 500 µl of
Trizol® reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mixed
with 500 µl of the supernatant. The mixture was
extracted with 220 µl of cold chloroform. After
centrifuging at 12,000 xg for 15 min, the RNA contained
in the aqueous solution was precipitated by adding 750
µl of isopropanol. The precipitated RNA was collected
by centrifugation at 12,000 xg for 15 min, washed with
70% ethanol, and dissolved in 50 µl of RNase-free
water.
DNAse treatment and reverse transcription (RT-
PCR): DNAse I Amplification Grade (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) was used to remove traces of
entrained genomic DNA in RNA extraction by digestion
at 37 °C for 30 min. Complementary DNA (cDNA) was
synthesized using a reaction mixture containing 1 μg of
total RNA, random hexamers (12 ng / μl), and the
reverse transcriptase enzyme from Moloney murine
leukemia virus (Invitrogen, USA), following the
manufacturer's suggested procedures. Negative controls
were performed, omitting RNA or reverse transcriptase.
Then the cDNA was stored in a freezer at -20 °C for use
in qPCR amplifications.
Quantitative PCR Amplification (qPCR) and studied
Effects of dietary supplementation with abscisic acid on Apis mellifera colonies confined in overwintering nucleus
21 Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1
genes: The cycling programs for DNA amplifications
consisted of an initial denaturation of 2 min at 95 °C and
45 cycles of 10 s at 95 °C, 15 s at the specific
hybridization temperature and 15 s at 72 °C. All qPCR
reactions were carried out in a Rotor-Gene 6000 thermal
cycler (Qiagen, Hilden, Germany) in a final volume of
20 μl using EvaGreen as an intercalating fluorescent dye
(KAPA FAST, Biosystems, Woburn, USA). All
determinations were made with a primer concentration
between 448 to 900 mM.
Table 1 summarizes the primers (synthesized by
Eurofins MWG Operon, USA) used in the qPCRs of this
study, with their respective specific annealing and
melting temperatures. Amplifications were normalized
by analysing the constitutively expressed β-actin of A.
mellifera (Yang & Cox-Foster, 2005). Specific primers
for β-actin amplification are found in Table 1. The cycle
program consisted of an initial denaturation of 2 min at
95 °C and 40 cycles of 10 s at 95 °C, 15 s at 60 °C and
15 s at 72 °C. After amplification, a melting curve
analysis was performed, which resulted in an individual
product-specific melting curve.
Relative expression (RE) values were calculated by
the 2− ΔΔCt method (Livak & Schmittgen, 2001). Each of
the four targets was analysed separately and normalized
to A. mellifera β-actin. The amplification efficiency was
determined for each gene using 10-fold dilutions of
cDNA. In all assays, standard curves for each gene had
a slope between -3.2 and -3.5, and the standard deviation
between duplicates was in all cases <0.167, as
recommended for qPCR (Bustin, 2002).
Statistical analysis
The effects of the treatments with ABA on the
population degree of adult bees (number of combs
covered by bees during overwinter) were evaluated with
generalised linear mixed models (GLMM). We also
assumed normal distribution of the variable “population
grade” given the nature of the response variables and the
structure of the sampling design (repeated measures of
bees per colony) (Pinheiro & Bates, 2000; Gelman &
Hill, 2006). The diet treatment, a categorical variable
with two levels, and time of the year (before, during, and
after winter) were included as fixed effects, and
"colony" was included as the random effect.
Generalized linear models of mixed-effects were
used to evaluate the effects of the treatments on the
abundance and prevalence of Nosema spp. in autumn
(May 17), winter (August 5), and late winter (September
19), given the nature of the response variables and the
structure of the sampling design (repeated measures of
bees per colony) (Pinheiro & Bates, 2000; Gelman &
Hill, 2006). Since the response variables for the analysis
of the abundance of Nosema spp. follows a discrete
nature (number of spores per bee), the model assumed a
Poisson distribution. As the response variable for the
prevalence analysis of Nosema spp. follows a
distribution according to the Bernoulli test (infected
versus uninfected bees), the model assumed a binomial
distribution with logarithmic function. The diet
treatment and its interaction with the time of the year
(before, during, and after winter) were included as fixed
effects and "colony" as the random effect. Data analysis
was carried out using the lmer function of the lme4
package (Bates et al., 2015). A post-hoc test was then
anperformed using the Tukey test for multiple
comparisons of means using the LSMean function of the
package LSMeans (Lenth, 2017) of R software 4.0.0
(Team, 2016).
The effects of the treatments on gene expression
levels were evaluated on the quantification time
corresponding to the T2 sampling (August 4, winter
period). T-test was applied to the data set to each gene
Table 1. Primer sequences, annealing temperatures (AT), melting temperatures (MT), and references.
Primers
Primers sequence (5’-3’)
A T
(°C)
M T
(°C)
Reference
β-actin- Fw
β-actin-Rv
ATGCCAACACTGTCCTTTCTGG
GACCCACCAATCCATACGGA
60
83.2
Yang & Cox-Foster, 2005
domeless- Fw
domeless-Rv
TTGTGCTCCTGAAAATGCTG
AACCTCCAAATCGCTCTGTG
53
78.5
Evans et al., 2006
nos- Fw
nos-RV
TCCACTCGCAGGTACTTTCC
TCTGGAGGATCACCATTTCC
54
76.7
Gregorc et al., 2012
toll18w- Fw
toll18w-Rv
CTCGGTAGCAATCCGTGGTC
CAATCGCCGCCTGTAAGC
59
91.2
Negri et al., 2020
vitellogenin- Fw
vitellogenin-Rv
AGTTCCGACCGACGACGA
TTCCCTCCCACGGAGTCC
54
80.5
Corona et al., 2007
N. Szawarski et al.
Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 22
that passed the normality test (Shapiro-Wilks test) and
homogeneity of variances (Levene's test). R software
4.0.0 (Team, 2016) was used for the analyses.
RESULTS
Effects of the supplementary diet with ABA on
the population dynamics of honey bee colonies
There were no significant differences between ABA
and the control treatment in each time-point analysed
(autumn, winter, and late winter) (GLMM: F=0.976,
p=0.336) regarding the effects of phytochemical
supplementation on the development of A. mellifera
colonies during overwintering (Fig. 1). In autumn (May
11), at the beginning of the experiment, colonies of both
treatments (C and ABA) had equivalent initial levels in
the adult bee population (C=2.75; ABA=2.875, mean
value of combs covered by adult bees or “ccab”). At the
time-point corresponding to winter (August 14), the
levels in adult bees for groups supplemented with ABA
(3.5 ccab) increased their population compared to that of
the control (2.67 ccab). However, these were not
significant. At the last time-point corresponding to the
late winter (September 15), the population levels of the
control group were balanced with the colonies of the
ABA group, resulting in 3.83 (C) and 3.63 (ABA)
combs covered with adult bees, respectively.
The effects of ABA supplementation on Nosema
spp. levels
The prevalence (percentage of bees parasitized) of
Nosema spp. during overwinter did not vary
Figure 1. Adult honey bee population in nuclei with and without supplement of 50 μM ABA. The results indicate that no significant
differences were found between the control group and the treatment with ABA over time (GLMM: F=0.976, p=0.336). Dots represent
data points. Thin bars indicate +/- standard deviation (SD).
Figure 1. Changes in the prevalence of Nosema spp. during overwintering. The percentage of parasitized forager honey bees during
overwinter did not vary significantly between the control and ABA treatments (GLMM: F=0.134, p=0.719). Dots represent data points.
Thin bars indicate +/- standard deviation (SD).
Effects of dietary supplementation with abscisic acid on Apis mellifera colonies confined in overwintering nucleus
23 Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1
significantly between ABA treatment and control group
(C) (GLMM: F=0.134, p=0.719) (Fig. 2). The dynamics
of Nosema spp. between autumn and winter behaved
similarly in both treatments. We found an increase in the
prevalence between autumn (May 17) and winter
(August 5), and then towards late winter (September
19), decreasing again in both treatments.
The abundance of spores of Nosema spp. (n°
spore/bee, from a pool of 60 individuals per colony)
during the assay did not vary significantly between ABA
treatment and the control group (C) (GLMM: F=0.97,
p=0.36) (Fig. 3). For each diet treatment (C or ABA),
spore loads per bee increased between autumn (May 17)
and winter (August 5); then decreased towards late
winter (September 19).
Effects of ABA dietary supplementation on the
expression of nutrition- and immune-related genes in
adult honey bees during winter
Gene expression analyses in nurse bees, calculated
as relative expression (RE), involved three immune
system genes (domeless, nos, toll18W) and a nutritional
response gene (Vitellogenin). All showed increased
levels compared to the control when the nucleus of
honey bees was fed with ABA in winter (T2=August 4).
However, this increase in ABA treatment was not
significant to the control group (domeless T-test, t=-
1.283, p=0.269; nos T-test, t=-0.818, p=0.45; toll18W T-
test, t=-1.092, p=0.325 and vitellogenin (Vg) T-test, t=-
1.483, p=0.212) (Fig. 4).
Figure 3. Nosema spp. spore abundance of forager worker bees during overwintering. The abundance of Nosema spp. during overwinter
did not vary significantly between the control and ABA treatments (GLMM: F=0.97, p=0.36). Dots represent data points. Thin bars
indicate +/- standard deviation (SD).
Figure 2. Nutrition- and immune-related gene expression of adult honey bees responding to supplementation (with and without 50 μM
ABA) during winter. The relative expression (RE) of the genes was studied in the sampling associated with winter (August 4) in nurse
honey bees (n=10). The RE analysis for all genes showed no significant effect when comparing ABA treatment with control (domeless
T-test, p=0.269; nos T-test, p=0.45; toll18W T-test, p=0.325 and vitellogenin T-test, p=0.212). Thin bars indicate + standard deviation
(SD).
N. Szawarski et al.
Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1 24
DISCUSSION
In this study, we evaluated the effect of ABA
supplementation on the overwintering of A. mellifera
nuclei. ABA application (50 μM) matched with the
range of concentrations previously reported in nectar,
honey, and honey bees (Tuberoso et al., 2010; Negri et
al., 2015; Ramirez et al., 2017). In addition, this
concentration has been shown to stimulate the immune
response of bee larvae reared in the laboratory against
different stress conditions (Ramirez et al., 2017; Negri
et al., 2017; 2020).
ABA supplementation did not impact the population
level of the treated colonies during overwintering.
However, positive tendencies could be seen in the time-
point corresponding to winter (August 14) for colonies
supplemented with ABA. This treatment maintained
higher adult bee levels in treated colonies than in the
control group, where the number of combs covered with
adult bees (ccab) was 3.5 and 2.67, respectively.
According to Delaplane et al. (2013), these values
represent 8,500 and 6,480 adult bees for ABA and
control groups, respectively. By the end of the winter
(September 15), both treatments reached a similar adult
bee population size (Fig. 1). This final equality between
the groups could be attributed to sporadic fluctuations in
climate and blooming of some plant species in the area
of study, impacting the population dynamics of honey
bee colonies (Döke et al., 2015). Although blooming
was not measured in this study, it could be hypothesized
that a high availability of floral resources at the end of
winter promoted colony growth levelling between
groups.
In a previous study by our research group (Szawarski
et al., 2019) carried out at Miramar, another area of the
province of Buenos Aires, results showed a positive
effect of ABA on both nutritional managements
evaluated (with syrup or honey), observing higher
population levels of adult bees at the end of winter than
those in their respective controls. This dynamic is
different from that seen in this experiment, where the
population levels of the control group were balanced
with the colonies of the ABA group during a similar
season (September 15). In addition, this could be due to
differences in the seasonal dynamics of the floral
resources present between the environments of both
experiments. Although flowering curves were not taken
into account in either of the two assays, the apiary
located in Miramar had specimens of the plant species
Myoporum laetum in its surroundings. This plant species
is characterized by being nectariferous and its flowering
begins at the end of winter. Perhaps the contribution of
its nectar stimulates the development of the colonies
associated with this experimental apiary. However, to
adequately answer these questions, we should study and
define in future experiments the corresponding
flowering curves of each of these environments. In
addition, another factor that could have influenced may
be linked to the differences between the population size
of the honey bee colonies of both experiments. As
previously mentioned, the colonies in this study were
assembled into a nucleus with smaller bee colonies, than
the honey bee colonies in the study of Szawarski et al.
(2019) (average of 3 vs 7 combs covered by adult bees,
respectively). In this context, a nucleus with low
population levels, given the supply of floral resources
from the environment, could fastly reach similar
population levels between both treatments. In view of
the results reported by Negri et al. (2015), we also
showed in this experiment that colonies supplemented
with ABA maintain the population levels of adult bees
after winter.
Regarding the effect of ABA on the levels of
Nosema spp., we selected two parameters to study the
parasite dynamics: prevalence and abundance. In
agreement with previous studies (Higes et al., 2008;
Botías et al., 2013; Retschnig et al., 2017), our results
showed that, during winter, there was an increase in
parasitized bee levels and spore load of Nosema spp.
This increment could be seen in colonies from both
treatments (with and without ABA). Therefore, this field
experiment would show no direct effect of ABA on the
percentage of parasitized bees and on the development
of Nosema spp. spores. Unlike our previous research
(Szawarski et al., 2019) where we had only studied the
dynamics of nosemosis in two time-points, autumn and
late winter, in the current experiment an extra
intermediate time-point was included, over the winter,
in which the highest levels of the prevalence and
abundance of Nosema spp. were obtained in both
treatments. However, as reported in Bernklau et al.
(2019), where some phytochemicals are shown to
promote worker bee longevity and Nosema tolerance,
future laboratory assays should be required to possibly
determine similar effects of ABA on Nosema parasitized
honey bees. In addition, during the whole assay period,
high values of prevalence of nosemosis were found,
which could be a variable acting on the results obtained.
In future assays we should consider, before conducting
the experiment, standardizing all bee colonies according
to prevalence levels of parasitosis.
The studied genes were associated with the immune
system of A. mellifera. Some are markers of the immune
pathways that respond to a diversity of risk factors:
Effects of dietary supplementation with abscisic acid on Apis mellifera colonies confined in overwintering nucleus
25 Enero - junio 2022 • Volumen 1 • Número 1
toll18W gene is associated with Toll pathways, and
domeless gene is associated with the JAK / STAT
pathway (Evans et al., 2006); nos gene (Gregorc et al.,
2012) regulates the synthesis of the enzyme nitric oxide
synthase, associated with the production of nitric oxide
(NO), a molecule that acts in signalling pathways and in
cytotoxic mechanisms against parasites and pathogens
(Rivero, 2006); and vitellogenin gene (Vg) (Corona et
al., 2007) regulates the synthesis of the lipoprotein
vitellogenin, usually used as a biomarker of the
nutritional status of individuals (Negri et al., 2019).
Concerning the expression of nutrition- and immune-
related genes of A. mellifera (Evans et al., 2006; Negri
et al., 2019, 2020), none of the studied genes (domeless,
nos, toll18W, and vitellogenin) showed significant
differences between the control group and the ABA
treatment group in the time-point associated with winter
(August 4). The lack of statistical differences between
ABA and control group was probably related to the
variability of the data and the low number of replications
for each treatment (N = 4 of ABA, N = 3 of control,
where N = honey bee nucleus). In addition, another
factor that could have masked the effects of the genes
studied is the age of the nurse bees sampled, since the
individuals were not of the same age, which could have
influenced on the variability of the data.
However, the four genes studied tended to increase
gene expression levels in the ABA treatment compared
to the control group. The tendency in the results of the
toll18W gene, which encodes the Toll immune pathway
receptor (Evans et al., 2006), correlates with that
reported by Negri et al. (2020), where they
demonstrated that bee larvae reared in vitro and supplied
with ABA show higher expression of the toll18W
receptor. This suggests that the ABA could have a
central role as an inducer molecule of the Toll immune
pathway in honey bee larvae. In addition, Negri et al.
(2020) also demonstrated that the expression of the gene
encoding for nitric oxide synthase (nos), the enzyme
responsible for NO synthesis, is induced by the ingestion
of ABA in A. mellifera larvae. This is supported by
previous reports where it has been demonstrated that
both ABA and NO were involved in the immune
response of honey bees (Negri et al., 2015, 2017).
Regarding gene domeless, a key component of the
JAK/STAT pathway (Evans et al., 2006), the results of
Negri et al. (2020) demonstrated that larvae only fed
with ABA tended to increase the level of expression of
this gene. Yet, when larvae were exposed to cold stress,
both groups, with and without ABA, showed higher
significant inductions of the domeless gene.
Another gene that tended to increase its expression
level between the ABA treatment and the control was
vitellogenin (Vg), related to stress responses (Münch &
Amdam, 2010; Ramirez et al., 2017) and nutritionally
regulated functions (Negri et al., 2019). The lipoprotein
Vitellogenin is also thought to play a central role in the
extended lifespan of the winter honey bees (Münch &
Amdam, 2010). In Ramirez et al. (2017),
supplementation with ABA in honey bee larvae reared
in vitro and exposed to cold stress led to a more
significant induction of Vg expression, which could be
correlated with the tendencies seen in our study.
CONCLUSIONS
The results showed no significant differences after
administering ABA on the population levels of adult
bees, Nosema spp. levels and on the expression levels of
the genes studied in a key period of the survival of the
honey bee colonies. However, taking into account the
positive tendencies observed in the variables measured,
more studies should be conducted on this topic, with
more colonies per group and measuring the blooming
period and plant species involved.
DISCLOSURE STATEMENT
No potential conflict of interest was reported by the
authors.
FUNDING
This work was supported by the Agencia Nacional
de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT)
through grants PICT-2012-0594 awarded to M.M. and
PICT 2013-0904 awarded to L.L.; N.S. gained a
fellowship by CONICET to develop his PhD thesis.
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Derechos de Autor (c) 2022 Nicolás Szawarski, Enzo Domínguez, Silvina Quintana, Gregorio De
Landa, Constanza Brasesco, Facundo Meroi Arcerito, Eugenia Olivera, Giulia Mitton, Facundo Ramos,
Martín Javier Eguaras, Lorenzo Lamattina, Matías Maggi
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REVISTA CIENTÍFICA DE
ABEJAS Y APICULTORES
VOLUMEN 1 - NÚMERO 1
enero - junio 2022 eunk.org